顯微鏡的產(chǎn)生和發(fā)展對于生命科學(xué)研究的進(jìn)步有至關(guān)重要的作用，它將微觀世界呈現(xiàn)在大***面前，包括微生物的存在、組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生理病理活動等。顯微鏡技術(shù)的不斷革新將成像分辨率不斷提高，但相當(dāng)長***段時間內(nèi)光學(xué)成像無法突破***個極限值，即xy軸橫向分辨率約200nm，z軸縱向分辨率約500nm，因此小于這個尺寸的生命活動和結(jié)構(gòu)，如病毒、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等無法清楚地觀察到。

聚焦點的光強會根據(jù)點擴散函數(shù)（point spread function，PSF）而展開，對于圓形孔徑，PSF呈現(xiàn)為艾里斑（Airy disk）的模式。激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）的分辨率取決于PSF的大小，如果焦點很小，則每個像素點獲取到的信息也很小，從而得到清晰銳利的圖像；反之，則結(jié)果圖像變得模糊。因此，CLSM成像的主要挑戰(zhàn)在于實現(xiàn)越來越小的PSF以獲得更好的分辨率。德***物理學(xué)***恩斯特·阿貝（Ernst Abbe，1840-1905年）在19世紀(jì)70年代***次提出阿貝衍射極限，即由于衍射效應(yīng)，PSF大小與λ/NA成正比（d=0.61λ/NA），其中λ是光的波長，NA是物鏡***重要的參數(shù)——數(shù)值孔徑。由于可見光波長范圍在400-760nm之間，NA值***大在1.7左右，所以分辨率極限在200nm左右。隨著物理學(xué)和測量技術(shù)的進(jìn)步，突破衍射極限的顯微鏡不斷涌現(xiàn)，公認(rèn)的超高分辨顯微鏡主要有三類，包括結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（Structured Illumination Microscopy，SIM），受激發(fā)射損耗顯微鏡（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED），和單分子定位顯微鏡（SMLM）。單分子定位顯微鏡包括光敏定位顯微鏡（Photoactivation Localization Microscopy，PALM）和隨機光學(xué)重構(gòu)顯微鏡（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。2014年三位科學(xué)***史蒂芬·霍爾（Stefan W. Hell）、埃里克·貝茲（Eric Betzig）和威廉·莫納（William E. Moerner）因他們在超高分辨顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)而獲得了諾貝爾化學(xué)獎。當(dāng)然，新興***低光子數(shù)顯微成像（MINimal Photon FLUXes，MINFLUX）作為第四類超高分辨顯微鏡，也被更多的學(xué)者了解和關(guān)注。

超高分辨顯微鏡成像既利用了光學(xué)顯微成像原有的無損性質(zhì)（與電鏡高分辨成像相比），又可以很好地突破普通顯微鏡中衍射極限對成像分辨率的限制，因此其發(fā)明和發(fā)展對于生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究具有非常重要的意義。不同類型的超高分辨顯微鏡自問世后均被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域中，包括生命體細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的探索以及疾病的發(fā)生發(fā)展機制等。不過，不同類型的超高分辨顯微鏡由于空間分辨率、時間分辨率、光漂白和光損傷等諸多問題，實際應(yīng)用中各有利弊。雖然成像技術(shù)發(fā)展很快，但技術(shù)限制依舊存在，如何獲得更高的空間分辨率、更深的成像深度和更快的時間分辨率以滿足更精確更快生物過程的研究依舊任重道遠(yuǎn)。

SIM技術(shù)的前身可以追溯到20世紀(jì)70年代初。當(dāng)時，光學(xué)學(xué)***特奧多爾·赫普恩（Theodor H?upl）***次提出了使用周期性光柵照明來提高顯微鏡分辨率的想法。這奠定了SIM技術(shù)的基礎(chǔ)，盡管當(dāng)時還沒有實體的SIM顯微鏡。21世紀(jì)初期，SIM技術(shù)開始廣泛傳播，吸引了生物學(xué)***和顯微鏡專***的關(guān)注，它是***種相對低成本的超高分辨率成像方法，因為它不需要昂貴的激光設(shè)備或復(fù)雜的樣品準(zhǔn)備。

SIM本質(zhì)是激發(fā)光透過可橫向移動的光柵產(chǎn)生正弦條紋圖案照射樣品，正弦條紋照明圖案與樣品本身的信息疊加形成莫爾條紋，將樣品結(jié)構(gòu)中的高空間頻率信息轉(zhuǎn)變?yōu)榭赏ㄟ^物鏡收集的較低空間頻率信息，***后通過后期數(shù)據(jù)處理得到樣品的高分辨圖像。SIM的單幅原始圖像的采集速度只取決于樣品的熒光信號強度和探測器的采集速度，通常只需要采集9幀原始圖像，與基于點掃描成像的STED和需要采集幾萬幀原始圖像的SMLM相比，要快得多，基本可以達(dá)到實時觀察。但SIM受其成像原理的制約，***多只能將橫向分辨率提升為傳統(tǒng)顯微鏡的2倍（即100 nm左右），因此分辨率遠(yuǎn)不及其他超高分辨顯微鏡技術(shù)。但SIM對熒光探針沒有光開關(guān)或抗淬滅的特殊需求，其***大的優(yōu)勢也是寬場成像速度快，所以更多更廣泛地應(yīng)用在活細(xì)胞成像領(lǐng)域。

單分子定位顯微鏡中熒光標(biāo)記的單個分子被分別激發(fā)和檢測，可以極高的精度確定單分子的中心從而實現(xiàn)高分辨率，包括光敏定位顯微鏡（Photoactivation Localization Microscopy，PALM）和隨機光學(xué)重構(gòu)顯微鏡（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。

PALM的歷史可以追溯到2006年，由埃里克·貝茲（Eric Betzig）和哈拉爾德·赫斯（Harald Hess）提出了單分子定位這***概念。同期STORM的成像技術(shù)也發(fā)展起來，代表是華人科學(xué)***莊小威。STORM和PALM工作原理類似，都是通過特殊的分子標(biāo)記和隨機活性化，實現(xiàn)單分子定位進(jìn)而實現(xiàn)超高分辨率成像。在SMLM成像中，光開關(guān)熒光蛋白（PALM）或閃爍染料（STORM）扮演著重要角色，它們在“開態(tài)”和“關(guān)態(tài)”間可以相互轉(zhuǎn)換，處于開態(tài)時可被激發(fā)產(chǎn)生熒光，而處于關(guān)態(tài)時不發(fā)射熒光。在每***個成像周期內(nèi)隨機只讓***小部分熒光團打開，其余熒光團暫時關(guān)閉，這樣每***幅圖像中熒光團的光斑不會重疊，可以高精度地定位出每個熒光團的位置。重復(fù)這個過程，使每個周期內(nèi)都隨機打開***部分熒光團，這樣可以在不同時間點捕獲標(biāo)記物的位置，通過記錄標(biāo)記物的位置可以得到它們的坐標(biāo)，獲得足夠多的數(shù)據(jù)點可將所有的定位信息疊加起來，就能重構(gòu)出***幅超分辨圖像。這種以成像時間換取空間分辨率的形式，使得PALM或STORM的分辨率通常能夠達(dá)到數(shù)十納米。

德***科學(xué)***Stefan W. Hell于1994年***次理論上提出STED顯微鏡的概念，并在2000年進(jìn)行實驗驗證。STED超高分辨技術(shù)的基礎(chǔ)原理是利用受激發(fā)射效應(yīng)減小有效熒光發(fā)光面積，即在STED顯微成像中，通過使用***個激發(fā)光束和***個環(huán)形的耗損光束，使得熒光分子的激發(fā)區(qū)域比阿貝衍射極限更小。耗損光束通過受激發(fā)射將外圍的熒光分子去激發(fā)，只留下中心區(qū)域的熒光信號，從而實現(xiàn)納米***別的分辨率。我們也叫它“甜甜圈”技術(shù)。STED成像技術(shù)可以通過非線性效應(yīng)提高分辨率，即其分辨率與STED“甜甜圈”損耗光強有關(guān)，提高“甜甜圈”光的強度可以使熒光光斑焦點中心直徑縮小，但是實際應(yīng)用中，光損傷較大，“甜甜圈”光強不可能無限增加，顧其分辨率***高可達(dá)到30nm左右。此外，STED成像技術(shù)還包括對光束進(jìn)行精確調(diào)制、校準(zhǔn)和掃描，以及采用高性能探測器進(jìn)行成像，加之其“甜甜圈”光毒性、光淬滅等問題比較明顯，STED技術(shù)對熒光染料和封片劑的抗淬滅要求較高。

近年來，得益于新的硬件革新及技術(shù)手段的引入、熒光染料和探針的改進(jìn)、光學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)化和更精確的成像算法等，STED技術(shù)在分辨率和應(yīng)用方面都有了顯著提升，發(fā)展為易用、穩(wěn)定的成熟商業(yè)產(chǎn)品，逐步成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的研究工具。STED技術(shù)結(jié)合熒光壽命成像更是發(fā)揮了降低損耗光強度優(yōu)勢、打破相近波長染料不可共染的限制，進(jìn)***步降低了光漂白、提高了分辨率。